機(jī)械刺激（尤其是高應(yīng)變機(jī)械應(yīng)力）會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞分解代謝和死亡，與骨關(guān)節(jié)炎（OA）發(fā)病相關(guān)，而 OA 作為常見(jiàn)退行性關(guān)節(jié)疾病，其誘發(fā)因素和機(jī)制尚不明確。細(xì)胞死亡（尤其是程序性細(xì)胞死亡）與衰老相關(guān)，其中鐵死亡是一種以磷脂氧化損傷為特征的壞死性細(xì)胞死亡形式，GPX4 通過(guò)谷胱甘肽合成調(diào)控鐵死亡，Fsp1 則借助輔酶 Q10 抵御 GPX4 相關(guān)鐵死亡。Piezo1 作為機(jī)械敏感性鈣離子通道，其激活與細(xì)胞死亡及軟骨退變相關(guān)，且在機(jī)械刺激引發(fā)的鈣內(nèi)流和細(xì)胞生物物理變化中起重要作用。

基于此，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院骨科的研究團(tuán)隊(duì)為了探究鐵死亡與骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)聯(lián)及相關(guān)機(jī)制，通過(guò)構(gòu)建GPX4 條件性敲除小鼠模型和高應(yīng)變培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行研究。研究成果發(fā)表在Journal of advanced research期刊題為“Mechanical overloading induces GPX4-regulated chondrocyte ferroptosis in osteoarthritis via Piezo1 channel facilitated calcium influx”。

首先，為了探究機(jī)械應(yīng)力介導(dǎo)的鐵死亡在 OA 發(fā)展中的作用，研究人員從 OA 患者全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)中的負(fù)荷區(qū)和非負(fù)荷區(qū)收集軟骨樣本，發(fā)現(xiàn)負(fù)荷區(qū)軟骨損傷更顯著（圖 1A ），圖 1B 中的 X 射線顯示膝關(guān)節(jié)負(fù)荷區(qū)存在集中負(fù)荷（紅色箭頭），且該區(qū)域軟骨細(xì)胞的線粒體呈現(xiàn)鐵死亡特征（如膜增厚、萎縮）（圖 1C ）。微陣列分析顯示，負(fù)荷區(qū)軟骨細(xì)胞中鐵死亡標(biāo)志物 GPX4 的水平較非負(fù)荷區(qū)降低，且與衰老相關(guān)分子趨勢(shì)一致（圖 1D ）。

為了研究機(jī)械刺激對(duì)軟骨細(xì)胞鐵死亡的直接影響，研究人員對(duì)原代小鼠軟骨細(xì)胞施加 1 MPa、1 Hz 的機(jī)械應(yīng)力下培養(yǎng) 1 小時(shí)，隨后繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時(shí)并進(jìn)行 TEM 觀察 ，發(fā)現(xiàn)其線粒體出現(xiàn)鐵死亡相關(guān)結(jié)構(gòu)變化（圖 1E ），經(jīng)機(jī)械應(yīng)力刺激的軟骨細(xì)胞中 GPX4 水平（紅色箭頭）降低（圖 1F ）。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)高應(yīng)變負(fù)荷降低了 GPX4 的 mRNA（圖 1G）和蛋白（圖 1H-1I）水平 ，免疫熒光染色也證實(shí)高應(yīng)變負(fù)荷導(dǎo)致 GPX4 水平降低（圖 1J-1K）。此外，在小鼠內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)（DMM）模型中，關(guān)節(jié)軟骨表層區(qū)的 GPX4 水平較對(duì)照組顯著降低（圖 1L-1M）。

圖1 過(guò)度的應(yīng)力負(fù)荷會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

接著，研究人員通過(guò)建立他莫昔芬誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞特異性 GPX4 條件性敲除（GPX4-CKO）小鼠模型，探究 GPX4 在關(guān)節(jié)軟骨中的作用。與 GPX4+/+（野生型，WT）同窩小鼠相比，該模型小鼠發(fā)育正常，無(wú)骨骼異常（圖 2A-2D）。經(jīng)他莫昔芬處理后軟骨細(xì)胞中 GPX4 成功敲除（圖 2E）。此后，在注射他莫昔芬的 12 周齡 GPX4-CKO 小鼠和 WT 小鼠中建立DMM模型（圖 2F）。在建立DMM模型兩個(gè)月后，與WT小鼠相比，GPX4-CKO 小鼠膝關(guān)節(jié)骨贅形成更多（圖 2G-2H），番紅O 染色及組織學(xué)分析顯示其 OA 進(jìn)展更嚴(yán)重（圖 2I-2M）。同時(shí)，GPX4 缺陷小鼠的軟骨合成代謝標(biāo)志物（聚集蛋白聚糖、Col2）表達(dá)降低，分解代謝標(biāo)志物（MMP13、ADAMTS-5）表達(dá)升高（圖 2N-2O）

圖2 與 GPX4 相關(guān)的鐵死亡會(huì)加劇 OA 的發(fā)展。

為了探究 Piezo1 通道是否參與機(jī)械過(guò)載誘導(dǎo)的鐵死亡，研究人員對(duì)野生型小鼠原代軟骨細(xì)胞施加高應(yīng)變機(jī)械負(fù)荷并輔以 Piezo1 抑制劑 GsMTx4 處理。結(jié)果顯示，機(jī)械刺激誘導(dǎo)鈣內(nèi)流，GsMTx4 可緩解（圖 3A-3B）。GsMTx4 抑制 Piezo1 能減少機(jī)械刺激導(dǎo)致的細(xì)胞死亡（圖 3C-3D）。機(jī)械過(guò)載降低 GSH 表達(dá)（圖 3E） 、誘導(dǎo)線粒體鐵死亡損傷（圖 3F），GsMTx4 可減輕這些變化。機(jī)械過(guò)載還會(huì)增加 ROS 產(chǎn)生（圖 3G-3H）、損害線粒體膜電位（圖 3I-3J），減弱線粒體活性（圖 3K-3L），GsMTx4 對(duì) Piezo1 的抑制可逆轉(zhuǎn)這些變化。同時(shí)，機(jī)械過(guò)載降低 GPX4 表達(dá)并損害軟骨細(xì)胞代謝（圖 3Q-3R）。

圖3 機(jī)械過(guò)載通過(guò) Piezo1 離子通道誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。

為了進(jìn)一步探究 Piezo1 在OA發(fā)展中的作用， 研究人員構(gòu)建了DMM 骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型。結(jié)果表明，關(guān)節(jié)內(nèi)注射 Piezo1 抑制劑 GsMTx4 可減輕模型小鼠膝關(guān)節(jié)的骨贅形成（圖 4B-4C），改善軟骨老化及 OARSI 評(píng)分（圖 4D-4E），維持軟骨中 GPX4 的水平（圖 4F-4G）。此外，關(guān)節(jié)軟骨的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，在 DMM 模型中，GsMTx4 處理可增加合成代謝生物標(biāo)志物（聚集蛋白聚糖和 Ⅱ 型膠原）的表達(dá)，并抑制分解代謝分子（ADAMTS-5 和 MMP-13）的產(chǎn)生（圖 4H-4I）。

圖4 抑制 Piezo1 可減輕 DMM 骨關(guān)節(jié)炎模型中的軟骨老化。

接下來(lái)，為了研究 GPX4 與 Piezo1 通道在機(jī)械過(guò)載致軟骨細(xì)胞損傷中的相互作用，研究人員通過(guò)敲低 GPX4 軟骨細(xì)胞進(jìn)行探究。結(jié)果證實(shí)，軟骨細(xì)胞中 GPX4 的敲除效率較高（圖 5A-5E）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GsMTx4 雖能緩解機(jī)械過(guò)載引起的鈣內(nèi)流（圖 5F-5G）。然而，無(wú)論是否抑制 Piezo1 通道，細(xì)胞死亡率均無(wú)顯著差異（圖 5H-5I）。機(jī)械應(yīng)力仍會(huì)降低谷胱甘肽（GSH）的表達(dá)（圖 5J），但由于 GPX4 表達(dá)不足，GsMTx4 無(wú)法維持 GSH 含量。 在 GPX4 缺失情況下，抑制 Piezo1 通道無(wú)法減少機(jī)械過(guò)載誘導(dǎo)的ROS 產(chǎn)生（圖 5K-5L）以及無(wú)法改善軟骨細(xì)胞代謝（圖 5M-5O）。GPX4 敲低會(huì)削弱 GsMTx4 對(duì)機(jī)械過(guò)載介導(dǎo)的線粒體膜電位損傷（圖 5P-5Q）和線粒體破壞（圖 5R-5S）的保護(hù)作用。

圖5 在 GPX4 缺陷小鼠中，抑制 Piezo1 通道無(wú)法逆轉(zhuǎn)機(jī)械過(guò)載誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷。

鑒于紊亂的鈣內(nèi)流可引發(fā)鐵死亡且機(jī)械過(guò)載誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞鐵死亡時(shí)伴隨鈣離子內(nèi)流增加，研究通過(guò)使用無(wú)鈣培養(yǎng)基培養(yǎng)野生型小鼠軟骨細(xì)胞，探究鈣離子是否為機(jī)械過(guò)載誘導(dǎo)鐵死亡所必需。結(jié)果表明，無(wú)鈣環(huán)境下機(jī)械刺激不會(huì)引發(fā)明顯鈣內(nèi)流（圖 6A-6B），且能大幅降低軟骨細(xì)胞死亡率（圖 6C-6D）。抑制鈣內(nèi)流后， 可以維持谷胱甘肽水平（圖 6E），減少活性氧產(chǎn)生（圖 6F-6G），減輕線粒體損傷（圖 6H-6I）并維持其膜電位（圖 6J-6K）。在應(yīng)對(duì)機(jī)械過(guò)載時(shí)，鈣內(nèi)流的缺失還能維持 GPX4 水平，減少分解代謝生物標(biāo)志物產(chǎn)生并促進(jìn)合成代謝生物標(biāo)志物分泌（圖 6M-6R）。

圖6 機(jī)械刺激誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生鐵死亡需要鈣內(nèi)流的參與。

總之，本研究闡述了機(jī)械過(guò)載在軟骨細(xì)胞中作用的潛在機(jī)制：機(jī)械過(guò)載通過(guò)激活 Piezo1 并隨后引發(fā)軟骨細(xì)胞內(nèi)的鈣內(nèi)流，從而誘導(dǎo)鐵死亡。這些信息可能為骨關(guān)節(jié)炎及其他軟骨退行性疾病的潛在治療干預(yù)提供思路。

參考文獻(xiàn)：Wang S, Li W, Zhang P, Wang Z, Ma X, Liu C, Vasilev K, Zhang L, Zhou X, Liu L, Hayball J, Dong S, Li Y, Gao Y, Cheng L, Zhao Y. Mechanical overloading induces GPX4-regulated chondrocyte ferroptosis in osteoarthritis via Piezo1 channel facilitated calcium influx. J Adv Res. 2022 Nov;41:63-75. doi: 10.1016/j.jare.2022.01.004. Epub 2022 Jan 11. PMID: 36328754; PMCID: PMC9637484.

原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC9637484/

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