骨關(guān)節(jié)炎（OA）作為一種常見的退行性關(guān)節(jié)疾病，病理機制復雜，涉及軟骨降解、滑膜炎癥、軟骨下骨硬化等多個方面，嚴重影響人類生活質(zhì)量。但由于對其進展機制缺乏了解，當前治療手段僅能緩解癥狀或延緩進展，晚期需依賴關(guān)節(jié)置換手術(shù)，因此闡明 OA 發(fā)病的潛在機制對探索創(chuàng)新治療方法至關(guān)重要。

關(guān)節(jié)軟骨作為與外力相關(guān)的生物力學部位，其發(fā)病與機械負荷密切相關(guān)，生理狀態(tài)下軟骨細胞會承受日?；顒訋淼膽?、應變等，而異常機械過載則可能導致軟骨細胞凋亡、細胞外基質(zhì)退化，進而引發(fā) OA。其中，流體剪切應力（FSS）是關(guān)鍵的生理和病理因素，較低的剪切應力具有軟骨保護作用，較高的剪切應力則會誘導炎癥反應、促進基質(zhì)降解酶表達，導致 OA 樣病理特征。鑒于軟骨組織修復和再生能力有限，深入研究 FSS 誘導 OA 發(fā)病的潛在機制具有重要意義。

近年來，表觀遺傳改變因其可介導多種病理反應而受到廣泛關(guān)注，其中組蛋白的甲基化、磷酸化、乙?；刃揎棔{(diào)控參與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵基因，例如 NSD3 組蛋白甲基化活性升高可驅(qū)動肺鱗狀細胞癌惡性進展，提示了相關(guān)治療策略的潛力。對于骨關(guān)節(jié)炎，已有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?；福?/span>HDAC）表達異常，暗示調(diào)節(jié)特定 HDAC 活性可能成為治療 OA 的方向，另有研究證實 EZH2 可通過促進 miR-138 啟動子的組蛋白甲基化抑制其表達，進而抑制 OA 進展。然而，盡管多項研究提示表觀遺傳在 OA 發(fā)病中具有潛在作用，但其詳細調(diào)控機制、基于表觀遺傳的治療靶點，尤其是與機械力相關(guān)的 OA 發(fā)病中的表觀遺傳調(diào)控具體機制仍不明確。

因此，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院口腔正畸科的研究團隊通過體外FSS 模型和體內(nèi)單側(cè)前牙反合（UAC）小鼠模型，明確異常 FSS 對原代軟骨細胞的影響，闡明 H3K4me3 在異常 FSS 誘導 OA 中的作用，同時探究表觀遺傳調(diào)控在機械相關(guān)軟骨發(fā)病中的作用，以及靶向表觀遺傳事件作為未來治療策略的可能性。研究成果發(fā)表在Journal of inflammation research期刊，題為“Aberrant Fluid Shear Stress Contributes to Articular Cartilage Pathogenesis via Epigenetic Regulation of ZBTB20 by H3K4me3 ”。

首先，研究人員對原代軟骨細胞施加 20 達因 / 平方厘米的流體FSS 并處理 2 小時，以探究異常高剪切應力的影響。結(jié)果顯示，FSS 會顯著破壞細胞形態(tài)（表現(xiàn)為 F - 肌動蛋白排列不規(guī)則）（圖 1A），且通過 EdU 染色發(fā)現(xiàn)，FSS 作用下的原代軟骨細胞增殖能力和活力均有所下降（圖 1B）。

然后，研究人員進一步研究了 FSS 對軟骨相關(guān)標志物、分解代謝反應、炎癥相關(guān)因子及細胞外基質(zhì)降解的影響。結(jié)果顯示：FSS 處理后，軟骨相關(guān)標志物 Sox9、Acan、Col2 的 mRNA 水平顯著下調(diào)，而肥大相關(guān)標志物（如 Col10、Cox-2 、Adamts4 和 Adamts5 ）、多種基質(zhì)金屬蛋白酶（包括 Mmp3、Mmp9 和 Mmp13 ）及典型炎癥因子（TNF-α、IL-1β 和 IL-6 ）均顯著上調(diào)。蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光實驗也證實，FSS 會抑制 COLII 和 SOX9 的表達，升高 COX-2 和 MMP13 的水平（圖 1D ）。免疫熒光實驗也一致顯示，異常 FSS 對原代軟骨細胞具有負向調(diào)控作用（圖 1E）。

圖 1 異常 FSS 對原代軟骨細胞的生物學影響

接著，由于組蛋白甲基化是基因表達中最重要的表觀遺傳調(diào)控方式之一，研究人員檢測了經(jīng) FSS 處理的軟骨細胞中主要的組蛋白甲基化修飾（H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3、H3K36me3和 H3K79me3）。結(jié)果顯示 ，FSS 處理后 H3K4me3 顯著過表達，而 H3K27me3 表達受抑制（圖 2A ），且免疫熒光實驗證實 FSS 會使軟骨細胞中 H3K4me3 顯著上調(diào)（圖 2B）。由于 H3K4me3 與基因激活密切相關(guān)，研究進一步探究其激活機制，結(jié)果顯示 FSS 處理后組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶 Kmt2b 的 mRNA 表達及 KMT2B 蛋白水平均明顯升高（圖 2C和圖 2D），表明FSS 可能通過上調(diào) KMT2B 來激活 H3K4me3。

圖2 FSS 導致 H3K4me3 激活和 KMT2B 上調(diào)。

由于H3K4me3 激活在 OA 中起重要作用，研究人員用 MM-102 抑制其活性進行探究。實驗先用 20μM MM-102 預處理細胞 24 小時，再用常用于模擬軟骨細胞凋亡的SNP（500μM）孵育，結(jié)果顯示 MM-102 預處理減輕了 SNP 對軟骨細胞的凋亡刺激（圖 3A）。更重要的是，MM-102 預處理有效逆轉(zhuǎn)了 FSS 對軟骨細胞的負面影響，這為基于表觀遺傳學的 OA 治療提供了基礎（圖 3B 和3C）。

圖3 通過 MM-102 藥理學抑制 H3K4me3 激活可部分逆轉(zhuǎn) FSS 對軟骨細胞的負面影響。

接下來，為了探究 FSS 誘導 OA 的分子機制，研究人員先通過轉(zhuǎn)錄組分析確定 FSS 處理后 430 個上調(diào)基因，再經(jīng) CUT&Tag 測序發(fā)現(xiàn) 586 個受 H3K4me3 調(diào)控的基因，兩者交集篩選出 10 個基因（Capn12、Cldn1、Gpcpd1、Il13ra2、Mex3b、Nexn、Slc20a1、Srek1、Tgif1 和 Zbtb20）（圖 4A）。經(jīng) qPCR 驗證，Zbtb20 是 FSS 處理后上調(diào)最顯著的基因（圖 4B），故被選為潛在的 H3K4me3 靶基因。CUT&Tag 驗證顯示 Zbtb20 是 FSS 引起的 H3K4me3 激活的直接靶標（圖 4D），且 FSS 處理后 ZBTB20 蛋白表達顯著升高（圖 4E），而 MM-102 預處理可逆轉(zhuǎn) FSS 導致的 ZBTB20 在 mRNA 和蛋白水平的升高（圖 4F 和 4G）。以上結(jié)果表明，ZBTB20 直接受 FSS 誘導的 H3K4me3 激活調(diào)控。

圖4 在暴露于 FSS 的軟骨細胞中確定 ZBTB20 為 H3K4me3 的靶基因。

為進一步研究 ZBTB20 對軟骨細胞的調(diào)控作用，研究人員通過腺病毒實現(xiàn) ZBTB20 過表達。qPCR 和 Western blot 結(jié)果驗證了原代軟骨細胞中 ZBTB20 的過表達成功（圖 5A）。結(jié)果顯示其會誘導軟骨細胞凋亡（圖 5B），抑制 Col2、Sox9 和 Acan 的 mRNA 表達（圖 5C），同時上調(diào) Col10、Cox-2 等肥大與分解代謝相關(guān)標志物（圖 5C），以及 Mmp 家族和炎癥因子（圖 5C），表明 ZBTB20 對軟骨細胞有負面影響，會引發(fā)基質(zhì)降解和炎癥反應。ZBTB20 過表達后，COLII 和 SOX9 的蛋白表達顯著下調(diào)，而 COX-2 和 MMP13 的水平顯著升高（圖 5D）。鑒于 Wnt 信號通路與機械刺激響應及關(guān)節(jié)疾病相關(guān)，且 KEGG 富集分析涉及該通路，進一步研究發(fā)現(xiàn) ZBTB20 過表達可激活 Wnt 信號通路（β- 連環(huán)蛋白水平顯著上調(diào)）（圖 6A ）。而 Wnt/β- 連環(huán)蛋白抑制劑 LF3 處理能有效緩解 ZBTB20 的負面影響，減少細胞凋亡（圖 6B）。在過表達 ZBTB20 且經(jīng) LF3 處理的軟骨細胞中，軟骨相關(guān)的正向標志物 Sox9、Col2 和 Acan 的表達得到改善，而代表軟骨退化和炎癥反應的標志物表達降低（圖 6C ）。Western blot 實驗也得到了相同結(jié)果，表現(xiàn)為 LF3 處理的細胞中 COLII 和 SOX9 上調(diào)，COX-2 和 MMP13 下調(diào)（圖 6D ）。

圖5 ZBTB20 顯著影響原代軟骨細胞的生物學表型、軟骨退化及炎癥反應。

研究發(fā)現(xiàn) FSS 會激活 Wnt 信號通路（圖 6E），為明確該通路是否參與異常 FSS 誘導的軟骨發(fā)病，使用 Wnt/β- 連環(huán)蛋白抑制劑 LF3 進行實驗，結(jié)果顯示 LF3 預處理可逆轉(zhuǎn)SNP 引起的細胞凋亡（圖 6F），且能減輕 FSS 對原代軟骨細胞的破壞，使 COLII、SOX9 水平升高，COX-2、MMP13 水平降低（圖 6G和6H）。由此推測，FSS 通過 KMT2B-H3K4me3-ZBTB20 介導的 Wnt 信號通路激活來破壞軟骨。

圖6 Wnt 信號通路密切參與 ZBTB20 或 FSS 介導的軟骨發(fā)病機制。

研究人員通過 UAC 小鼠模型（模擬異常咬合誘導的 TMJOA）進行體內(nèi)驗證，結(jié)果顯示 UAC 組小鼠存在明顯的軟骨降解和退化：顯微 CT 顯示，與假手術(shù)對照組相比，UAC 組的骨密度（BMD）、骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁數(shù)量（Tb.N）降低，而骨小梁分離度（Tb.Sp）增加（圖 7A）；UAC 組中 Col2 和 Sox9 的 mRNA 表達水平下調(diào)，Cox-2 和 Mmp13 的 mRNA 表達水平上調(diào)（圖 7B）；H&E 和番紅 O 染色顯示UAC 小鼠 的OARSI 評分升高和軟骨細胞密度降低 （圖 7C）；免疫組化顯示，UAC 組的 COLII、SOX9 蛋白減少，COX-2、MMP13 蛋白增加（圖 7D）。同時，UAC 小鼠顳下頜關(guān)節(jié)組織中 H3K4me3 和 ZBTB20 被強烈激活（陽性細胞數(shù)量顯著增多）（圖 7D）。在異常機械力誘導的 TMJOA 中，H3K4me3 和 ZBTB20 的表達失調(diào)， 表明H3K4me3-ZBTB20 軸可能在剪切應力相關(guān)的顳下頜關(guān)節(jié)發(fā)病中發(fā)揮調(diào)控作用。異常 FSS 誘導 OA 的基于表觀遺傳學機制的整體工作模型如圖 8 所示。

圖7 體內(nèi)單側(cè)前牙反合小鼠模型驗證。

圖8 異常 FSS 誘導 OA 的基于表觀遺傳學機制的整體工作模型。

總之，研究揭示了高 FSS 相關(guān)軟骨發(fā)病中的新表觀遺傳修飾，明確 H3K4me3-ZBTB20 是關(guān)鍵介導因子，且抑制 H3K4me3 或 Wnt 信號可部分逆轉(zhuǎn) FSS 對軟骨細胞的破壞。該研究發(fā)現(xiàn) OA 發(fā)病中機械應力與表觀遺傳事件的潛在關(guān)聯(lián)，為基于表觀遺傳學的關(guān)節(jié)疾病治療方法提供了基礎。

參考文獻：Jin Y, Li Z, Wu Y, Li H, Liu Z, Liu L, Ouyang N, Zhou T, Fang B, Xia L. Aberrant Fluid Shear Stress Contributes to Articular Cartilage Pathogenesis via Epigenetic Regulation of ZBTB20 by H3K4me3. J Inflamm Res. 2021 Nov 19;14:6067-6083. doi: 10.2147/JIR.S339382. PMID: 34824542; PMCID: PMC8610757.

原文鏈接：https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC8610757/

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